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一文看懂 | 如何用Annexin VPI法做細胞凋亡檢測

更新時間:2025-02-07      點擊次數:226

細胞凋亡過程常伴隨著明顯的細胞形態(tài)學變化,比如細胞凋亡早期,質膜內側的磷脂酰絲氨酸會翻轉到細胞質膜表面;而在凋亡的中后期,隨著細胞質膜通透性的增大,一些較大分子的化合物,如碘化丙啶(PI),便可自由擴散進入細胞,將細胞核染上紅色熒光。

Annexin VPI檢測法原理

Annexin V是一種鈣依賴性磷脂結合蛋白,能與PS高親和力特異性結合。它不能透過完整的細胞膜,而早期凋亡細胞的細胞膜是完好的,對PI有拒染性。但在凋亡中晚期的細胞和死細胞,PI能透過細胞膜而使細胞核染上。因此Annexin V 和PI同時使用,可以將凋亡早期的細胞與其它細胞區(qū)別開來。

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Annexin VPI凋亡檢測推薦(李記生物)

[名稱]  流式凋亡檢測試劑盒

[貨號]  AC12L033

[規(guī)格]  100T

Annexin VPI檢測法操作步驟

? 對照管的設置

   1、空白管:誘導凋亡的細胞不加染料,用來調節(jié)電壓;

   2、單染管:分別需要只加PI和熒光標記的Annexin V兩個單染管,用來調節(jié)補償;

   3、實驗管:誘導凋亡的細胞加本次實驗的所有熒光染料;

   4、陰性管:正常培養(yǎng)細胞加入染料,確認細胞正常狀態(tài),排除假陽性。

? 懸浮細胞收集染色

   1、在進行完細胞凋亡刺激后,離心5分鐘,棄上清,收集細胞,用PBS輕輕重懸細胞并計數。

   2、取1~5×10^5重懸的細胞,離心5分鐘,棄上清,加入500µl 結合液輕輕重懸細胞。

   3、加入5µl Annexin V-FITC,輕輕混勻;再加入5 μL 碘化丙啶,輕輕混勻。

   4、室溫避光孵育10分鐘??梢允褂娩X箔進行避光。

   5、隨即進行流式細胞儀檢測,Annexin V-FITC為綠色熒光,PI為紅色熒光。

? 貼壁細胞收集染色

   1、把細胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內,PBS洗滌貼壁細胞一次,用胰酶細胞消化液(最好不用含有EDTA)消化細胞。

   2、細胞消化下來后,同理懸浮細胞的操作步驟。

? 上機檢測

      染色孵育后,立即進行流式細胞儀檢測或熒光顯微鏡檢測。

Annexin VPI流式結果圖(僅做參考)

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圖:流式細胞儀凋亡檢測結果圖

 ? 左上象限(Annexin V-/PI+):為細胞碎片、機械損傷細胞或其它死細胞;Annexin V-/PI+象限中細胞數越多,實驗結果可信度就越低,因盡量控制本象限細胞比例。

 ? 左下象限(Annexin V-/PI-):為正常的活細胞;

 ? 右上象限(Annexin V+/PI+):為晚期凋亡細胞或壞死細胞,細胞膜損傷的細胞DNA可被PI著染產生紅色熒光;

 ? 右下象限(Annexin V+/PI-):為早期凋亡細胞,在細胞凋亡的早期PI無法著染,不會產生紅色熒光信號。

Annexin VPI檢測法注意事項

 • 檢測貼壁細胞時,若不好控制消化時間,建議用Accutase細胞消化液,對細胞損傷小且不會改變細胞膜上PS的分布。

 • 選擇Annexin-V的熒光染料時要考慮細胞的自發(fā)熒光,特別是培養(yǎng)時間久或藥物處理的細胞,一定注意細胞代謝物藥物本身的熒光,一般來說細胞代謝物的自發(fā)熒光會干擾FITC/PE,所以可建議用Annexin-V APC,藥物的干擾可查看藥物本身的發(fā)射光譜是否會對檢測選擇的染料有影響。

 • 細胞染色完成后,禁止固定,盡快檢測完,可將檢測管放冰上,可減少外界環(huán)境對檢測結果的影響。

 • 在做凋亡統(tǒng)計時一般指統(tǒng)計前凋亡,因為只有前凋亡才有意義,當然也有文獻統(tǒng)計總的凋亡比例(前凋亡和晚期凋亡之和),單純的統(tǒng)計晚期凋亡比例意義不大。


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