細胞凋亡過程常伴隨著明顯的細胞形態(tài)學變化，比如細胞凋亡早期，質膜內(nèi)側的磷脂酰絲氨酸會翻轉到細胞質膜表面；而在凋亡的中后期，隨著細胞質膜通透性的增大，一些較大分子的化合物，如碘化丙啶(PI)，便可自由擴散進入細胞，將細胞核染上紅色熒光。

Annexin VPI檢測法原理

Annexin V是一種鈣依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。它不能透過完整的細胞膜，而早期凋亡細胞的細胞膜是完好的，對PI有拒染性。但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能透過細胞膜而使細胞核染上。因此Annexin V 和PI同時使用，可以將凋亡早期的細胞與其它細胞區(qū)別開來。

Annexin VPI凋亡檢測推薦（李記生物）

[名稱]  流式凋亡檢測試劑盒

[貨號]  AC12L033

[規(guī)格]  100T

Annexin VPI檢測法操作步驟

? 對照管的設置

   1、空白管：誘導凋亡的細胞不加染料，用來調節(jié)電壓；

   2、單染管：分別需要只加PI和熒光標記的Annexin V兩個單染管，用來調節(jié)補償；

   3、實驗管：誘導凋亡的細胞加本次實驗的所有熒光染料；

   4、陰性管：正常培養(yǎng)細胞加入染料，確認細胞正常狀態(tài)，排除假陽性。

? 懸浮細胞收集染色

   1、在進行完細胞凋亡刺激后，離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)。

   2、取1~5×10^5重懸的細胞，離心5分鐘，棄上清，加入500µl 結合液輕輕重懸細胞。

   3、加入5µl Annexin V-FITC，輕輕混勻；再加入5 μL 碘化丙啶，輕輕混勻。

   4、室溫避光孵育10分鐘?？梢允褂娩X箔進行避光。

   5、隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

? 貼壁細胞收集染色

   1、把細胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細胞一次，用胰酶細胞消化液(最好不用含有EDTA)消化細胞。

   2、細胞消化下來后，同理懸浮細胞的操作步驟。

? 上機檢測

      染色孵育后，立即進行流式細胞儀檢測或熒光顯微鏡檢測。

Annexin VPI流式結果圖（僅做參考）

圖：流式細胞儀凋亡檢測結果圖

 ? 左上象限(Annexin V-/PI+)：為細胞碎片、機械損傷細胞或其它死細胞；Annexin V-/PI+象限中細胞數(shù)越多，實驗結果可信度就越低，因盡量控制本象限細胞比例。

 ? 左下象限(Annexin V-/PI-)：為正常的活細胞；

 ? 右上象限(Annexin V+/PI+)：為晚期凋亡細胞或壞死細胞，細胞膜損傷的細胞DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光；

 ? 右下象限(Annexin V+/PI-)：為早期凋亡細胞，在細胞凋亡的早期PI無法著染，不會產(chǎn)生紅色熒光信號。

Annexin VPI檢測法注意事項

 • 檢測貼壁細胞時，若不好控制消化時間，建議用Accutase細胞消化液，對細胞損傷小且不會改變細胞膜上PS的分布。

 • 選擇Annexin-V的熒光染料時要考慮細胞的自發(fā)熒光，特別是培養(yǎng)時間久或藥物處理的細胞，一定注意細胞代謝物藥物本身的熒光，一般來說細胞代謝物的自發(fā)熒光會干擾FITC/PE，所以可建議用Annexin-V APC，藥物的干擾可查看藥物本身的發(fā)射光譜是否會對檢測選擇的染料有影響。

 • 細胞染色完成后，禁止固定，盡快檢測完，可將檢測管放冰上，可減少外界環(huán)境對檢測結果的影響。

 • 在做凋亡統(tǒng)計時一般指統(tǒng)計前凋亡，因為只有前凋亡才有意義，當然也有文獻統(tǒng)計總的凋亡比例（前凋亡和晚期凋亡之和），單純的統(tǒng)計晚期凋亡比例意義不大。